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Diagnóstico Laboratorial de Influenza A H1N1  Livre

Autores:

Marcelo Litvoc

Médico da Disciplina de Infectologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP

Euclides F. de A. Cavalcanti

Médico Colaborador da Disciplina de Clínica Médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP

Última revisão: 14/05/2009

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Diagnóstico Laboratorial da Influenza A (H1N1)

            O diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus Influenza A (H1N1) é fundamental para a abordagem terapêutica individual e para as medidas de controle coletivas, e exames laboratoriais inespecíficos pouco auxiliam o diagnóstico. A fase de maior transmissibilidade da doença engloba o período entre um dia antes do início dos sintomas até o sétimo dia de evolução, devendo-se coletar as amostras respiratórias preferencialmente no início do quadro.

As amostras respiratórias preferenciais são:

 

  • swab ou aspirado nasofaríngeo/lavado ou aspirado nasal
  • alternativamente combinação do swab nasal com swab de orofaringe
  • aspirado traqueal em pacientes intubados
  •  

    Testes rápidos para vírus respiratórios humanos

                Os exames laboratoriais que confirmam a infecção pelo vírus influenza A (H1N1) são a cultura viral e o real time-PCR, mas são realizados até agora somente em laboratórios de referência mundial. Logo, uma tentativa de realizar o diagnóstico é a utilização de testes rápidos para vírus respiratórios humanos. O teste é baseado na detecção de antígenos nucleoprotéicos do vírus influenza A e B em amostras respiratórias, com a técnica de imunofluorescência direta. A sensibilidade do exame é de cerca de 50-70% em comparação com a cultura viral e a especifidade do exame é de 90-95% para os vírus respiratórios humanos.

    A positividade dos testes para o vírus influenza tipo A pode ser sugestiva para a infecção pelo novo vírus influenza A (H1N1), quando há antecedente epidemiológico importante, mas devemos ressaltar que estes testes foram padronizados para amostras respiratórias dos quadros de influenza sazonais humanos, sem determinação da sensibilidade e especificidade para o influenza A (H1N1).

     

    Exames de confirmação de infecção pelo vírus influenza A (H1N1)

    Como já ressaltado, o padrão ouro diagnóstico é feito com duas técnicas diagnósticas, reservadas para laboratórios de referência:

     

  • cultura viral (isolamento do virus influenza A (H1N1) é critério diagnóstico)
  • real time-PCR (RT-PCR)
  •  

                O real time-PCR é realizado para o influenza A, B, H1 e H3. O virus A (H1N1) deve ser positivo para influenza A e negativo para H1 e H3.

                Nos quadros de pneumonite pelo vírus influenza A (H1N1), pode-se enviar material das vias aéreas inferiores para análise histológica com provas de imunohistoquímica e PCR do fragmento.

     

    Coleta das amostras

                No Brasil, as recomendações oficiais para a investigação dos casos suspeitos da doença determinam a coleta das seguintes amostras:

     

    Secreções respiratórias

     

  • Coletar 3  swabs (da orofaringe e das narinas direita e esquerda), nos primeiros 7 dias após aparecimentos dos sintomas. Os três swabs no mesmo tubo, com no máximo 3 ml de salina fisiológica estéril, lacrar e identificar adequadamente o tubo. Manter refrigerado a 4ºC. O transporte do espécime ao laboratório deverá ser realizado no mesmo dia da coleta ou por período não superior a 24 horas, em caixa de isopor com gelo.  Não sendo possível, congelar a -70ºC e enviar em gelo seco ou nitrogênio líquido.
  • Os swabs a serem usados devem ser de rayon, estéreis, tamponado, com a haste de plástico. Swabs com haste de madeira e/ou com alginato de cálcio não devem ser utilizados
  •  

    Amostra de Sangue

                O Ministério da Saúde não recomenda a coleta de sangue e outras amostras clínicas para o diagnóstico. Amostras de sangue e outras amostras clínicas serão utilizadas apenas para monitoramento da evolução clínica do paciente e/ou para realização de diagnóstico diferencial, conforme hipóteses elencadas pelo médico do Hospital de Referência. Em caso de coleta, os procedimentos são os seguintes:

     

  • Utilizar frasco plástico contendo gel separador de plasma, assim a amostra de sangue pode ser centrifugado e transportado neste mesmo frasco. Pode ser colhido também em frasco estéril, sem anticoagulante. 
  • As amostras deverão ser colhidas amostras na fase aguda, ou seja, o mais precocemente possível até 7 dias após inicio dos sintomas. DEVERÁ ser colhida nova amostra de sangue após 3 semanas. Manter refrigerado a 4ºC ou no caso de soro manter congelado a 20 0 C. Enviar em caixa de isopor, com gelo reciclável.
  •  

    Recomendações do Ministério da Saúde

    As seguintes informações foram retiradas do protocolo de procedimentos – Influenza A (H1N1) - do Ministério da Saúde. Recomendamos aos profissionais de saúde a leitura do documento original (link para a íntegra do documento original)

     

    Coleta de Amostras Clínicas Para Diagnóstico Laboratorial

     

    1 - Informações gerais

     

  • Na atual fase de alerta de Emergência em Saúde Pública de Importância Internacional, o processamento das amostras de secreção respiratória de casos suspeitos para o diagnóstico de infecção pelo vírus de Influenza A(H1N1) deverá ser realizado apenas nos Laboratórios de Referência Instituto Adolfo Lutz (IAL), Instituto Evandro Chagas (IEC) e Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ/RJ). Estes laboratórios fazem parte da rede de laboratórios credenciados pela OMS.
  • Nesta fase as amostras de secreções respiratórias devem ser coletadas preferencialmente até o terceiro dia, após o início dos sintomas. Eventualmente, este período poderá ser ampliado até, no máximo, sete dias após o início dos sintomas.
  • A técnica de diagnóstico preconizada pela OMS para confirmação laboratorial de Influenza A(H1N1) é o RT-PCR em tempo real.
  • Não é recomendada a metodologia de Imunofluorescência Indireta (IFI) para detecção desse novo subtipo de Influenza A(H1N1).
  • Considerando as normas de biossegurança vigentes no país e as recomendações da OMS, o Ministério da Saúde reitera que a coleta de amostras de material humano seja rigorosamente realizada dentro das normas de biossegurança preconizadas para essa situação.
  • Os Hospitais de Referência poderão processar amostras de sangue ou outras amostras clinicas, que não sejam do trato respiratório, para monitoramento da evolução clínica do paciente. Amostras de secreção respiratória não devem ser processadas em nenhuma hipótese, fora dos laboratórios de referência acima relacionados.
  • Os LACEN poderão processar amostras de sangue ou outras amostras clínicas, que não sejam do trato respiratório, para subsidiar o diagnóstico diferencial, conforme hipóteses clinicas elencadas no Hospital de Referência, adotando-se as medidas de biossegurança preconizadas para cada situação.
  • As amostras de secreção respiratória coletadas dos pacientes em monitoramento deverão ficar armazenadas nos laboratórios de referência, devendo ser processadas somente após nova classificação do caso como suspeito ou nova orientação da vigilância epidemiológica
  •  

    2 - Tipo de amostra que deve ser coletada

     

    a)     Secreção respiratória: para investigação de influenza

    b)    Sangue e outras amostras clínicas: serão utilizadas apenas para monitoramento da evolução clínica do paciente e/ou para realização de diagnóstico diferencial, conforme hipóteses elencadas pelo médico do Hospital de Referência.

     

    3 - Procedimento para coleta de amostras

                Na atual fase de alerta de Emergência em Saúde Pública de Importância Internacional, as amostras de secreções respiratórias devem ser coletadas preferencialmente até o terceiro dia, após o início dos sintomas. Eventualmente, este período poderá ser ampliado até, no máximo, sete dias após o início dos sintomas.

                Preferencialmente, coletar utilizando a técnica de aspirado de nasofaringe com frasco coletor de secreção (bronquinho), pois a amostra obtida por essa técnica pode concentrar maior número de células.

                Na impossibilidade de utilizar a técnica de aspirado de nasofaringe, como alternativa, poderá ser utilizada a Técnica de Swab de Nasofaringe e Orofaringe, exclusivamente com swab de rayon.

                Não deverá ser utilizado swab de algodão, pois o mesmo interfere nas metodologias moleculares utilizadas.

                As amostras de secreção respiratória coletadas devem ser mantidas em temperatura adequada de refrigeração (4 a 80C) e encaminhadas aos LACENs no mesmo dia da coleta.

     

    4 - Transporte e acondicionamento de amostras

                Todas as unidades coletoras (Hospitais de Referência) deverão encaminhar as amostras ao Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN) de seu Estado ou Distrito Federal acompanhadas da ficha epidemiológica devidamente preenchida. A ficha está disponível no site do Ministério da Saúde no endereço www.saude.gov.br, link de Influenza A(H1N1).

                Para este transporte, as amostras deverão ser colocadas em caixas (térmicas) de paredes rígidas, que mantenham a temperatura adequada de refrigeração (4 a 8ºC) até a chegada ao LACEN.

                O LACEN deverá acondicionar a amostra em caixas específicas para Transporte de Substâncias Infecciosas, preferencialmente em gelo seco. Na impossibilidade de obter gelo seco, para esta Emergência de Saúde Pública de Importância Internacional, a amostra poderá ser congelada a -70ºC e encaminhar em gelo reciclável.

                O envio e a comunicação com a informação do “número de conhecimento aéreo” devem ser imediatos para o respectivo Laboratório de Referência. O transporte deve obedecer as Normas da Associação Internacional de Transporte Aéreo (IATA).

                Devido a presença do laboratório de referência em seu território, o município do Rio de Janeiro, de São Paulo e de Belém, deve enviar as amostras diretamente ao Laboratório de Referência para Influenza da Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz- (IOC), Instituto Adolfo Lutz (IAL) e Instituto Evandro Chagas (IEC), respectivamente.

     

    5 - Fluxo de envio de resultados

     

  • Laudos com resultados negativos para o novo subtipo de vírus Influenza A(H1N1) ou conclusivos para outros tipos de influenza: devem seguir o fluxo normal de informação.
  • Laudos com resultados confirmados para o novo subtipo de vírus Influenza A(H1N1): serão encaminhados primeiramente para o Ministério da Saúde que, após avaliação imediata da situação epidemiológica e dados clínicos, em conjunto com a SES, repassará as informações para as VE estaduais e municipais seguindo o fluxo do sistema de vigilância.
  •            

    Bibliografia

    http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/influenza_a_h1n1_protocolo_tratamento.pdf

    http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/rapid_testing.htm

    http://www.cdc.gov/h1n1flu/specimencollection.htm

    http://www.cdc.gov/h1n1flu/tissuesubmission.htm

    http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.htmftp:/ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/RESP/protocolo09_gripeA_IAL.pdfl

     

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